CRISPR/dCas介导的反沉默 – 将dCas蛋白重编程为异源沉默子的拮抗剂

原标题：CRISPR/dCas-mediated counter-silencing – Reprogramming dCas proteins into antagonists of xenogeneic silencers

J. WiechertBiel Badia RoigéDoris Dohmen-OlmaHindraXiafei ZhangRoberto G. StellaMarie A. ElliotJulia Frunzke

bioRxiv (2025)

5 分

关键词

CRISPRcosi

dCas9

sgRNA

CgpS

counter-silencing

promoter reactivation

gene silencing

fluorescence

prophage

transcriptome analysis

摘要

Lsr2样的类核蛋白作为异源沉默子（XSs）在放线菌中抑制水平获得的、富含AT的DNA的表达。转录因子的干扰可能导致XS靶向启动子的反沉默，但通常需要对启动子进行工程改造来解除这种抑制。在本研究中，我们开发了一种新型的CRISPR/dCas介导的反沉默（CRISPRcosi）方法，通过使用核酸酶缺陷型dCas酶来削弱Corynebacterium glutamicum中的Lsr2样XS蛋白CgpS或Streptomyces venezuelae中的Lsr2。利用dCas9和dCas12a以及不同导向RNA（gRNA）的系统体内报告研究显示，不同CgpS靶启动子的有效反沉默受导向RNA/dCas DNA结合的影响，而与启动子序列修改无关。当靶向CgpS成核位点时观察到最显著的CRISPRcosi效果，这一效应在S. venezuelae中靶向氯霉素生物合成基因簇内已知Lsr2成核位点时也有体现。分析缺乏XS蛋白CgpS的C. glutamicum菌株中的系统显示基于靶位置和链的CRISPR干扰（CRISPRi）效果具有不同的强度。在同时表达sgRNA/dCas9的C. glutamicum野生型菌株中进行的全基因组转录组分析揭示了高反沉默特异性，只有极小的脱靶效应。因此，CRISPRcosi提供了一种有前景的策略，用于精确上调XS靶基因，具有显著的潜力用于研究基因网络以及开发生物技术和合成生物学应用。意义：Lsr2样的类核蛋白作为异源沉默子（XSs），抑制在放线菌中水平获得的、富含AT的DNA的表达。Lsr2样蛋白的靶标非常多样，包括前噬菌体元素、毒力基因簇和生物合成基因簇。因此，XS靶基因的靶向激活对于基础研究和生物技术应用有重要意义。传统的反沉默方法通常需要对启动子进行修改。在本研究中，我们开发了一种新型的CRISPR/dCas介导的反沉默（CRISPRcosi）方法，利用核酸酶缺陷型dCas酶来对抗Corynebacterium glutamicum和Streptomyces venezuelae中的Lsr2样蛋白的抑制效果。效果最强时靶向Lsr2成核位点。全基因组转录组分析揭示出高特异性和极小的脱靶效应。总体来说，CRISPRcosi成为了一种能精确激活被异源沉默子沉默的基因的有力工具，为探索基因网络和推进生物技术应用提供了新的机会。

AI理解论文

该文档主要介绍了一种新的CRISPR/dCas9应用，即CRISPRcosi，用于反向激活被外源性沉默蛋白（XS）抑制的基因。传统的CRISPR干扰（CRISPRi）主要用于基因沉默，而CRISPRcosi则通过dCas9（一种失去核酸酶活性的Cas9变体）结合到特定的DNA序列上，干扰XS蛋白与DNA的结合，从而实现基因的反向激活。

研究背景

XS蛋白在细菌中广泛存在，通常用于沉默外源基因以保护宿主基因组的完整性。然而，这种高效的基因沉默机制在研究中常常成为障碍，因为它限制了特定基因的重新激活。传统的反向沉默方法依赖于转录因子（TF）的结合，但需要对启动子序列进行工程化改造，这限制了其应用范围。

方法与技术

CRISPRcosi通过使用**单导向RNA（sgRNA）引导dCas9到达目标启动子区域。sgRNA由三个部分组成：20个核苷酸的目标特异性间隔序列、优化的dCas9结合发夹结构和常用的转录终止子。sgRNA与DNA的互补性由间隔序列介导，并结合NGG原型间隔相邻基序（PAM）**序列，确保dCas9精确定位到特定的DNA位置。

在实验中，研究人员设计了多种sgRNA，分别靶向CgpS蛋白沉默的启动子区域。通过显微镜观察，验证了CRISPRcosi在Corynebacterium glutamicum中的有效性。实验结果表明，dCas9结合到模板DNA链或核心启动子区域外的区域时，反向沉默效果最佳。

实验结果

研究表明，CRISPRcosi能够有效解除CgpS对启动子的沉默，并激活下游基因的转录。通过与报告基因融合，研究人员能够通过荧光信号监测启动子活性。实验还表明，CRISPRcosi在Streptomyces venezuelae中能够解除Lsr2对氯霉素生物合成簇的抑制。

结论与贡献

CRISPRcosi提供了一种无需修改启动子序列的基因反向激活方法，具有精确和可调控的优点。与传统的TF方法相比，CRISPRcosi不依赖于特定的操作序列，因而具有更广泛的应用潜力。此外，研究还发现不同的dCas酶（如dCas9和dCas12a）在不同DNA链上的结合偏好不同，这为未来的研究提供了新的视角。

专业术语解释

CRISPR/dCas9：一种基于CRISPR技术的基因编辑工具，dCas9是失去切割功能的Cas9变体，用于基因调控而非编辑。
XS蛋白：外源性沉默蛋白，通常用于沉默外源基因。
sgRNA：单导向RNA，用于引导dCas9到特定的DNA序列。
PAM序列：原型间隔相邻基序，是CRISPR系统识别和结合DNA的必要序列。

通过该研究，CRISPRcosi展示了其在基因调控中的潜力，为基因功能研究和生物技术应用提供了新的工具和方法。

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