一个用于筛选神经活动调节因子的高度并行的CRISPR平台

该文档主要介绍了一项关于CRISPRi技术在神经科学研究中的应用的研究，重点在于通过CRISPRi筛选技术揭示与神经活动和神经疾病相关的基因调控机制。以下是对该文档的详细总结：

研究背景与目的

该研究旨在利用CRISPRi（CRISPR干扰）技术，结合CaMPARI2标记系统，进行大规模基因筛选，以识别和验证与神经活动和神经疾病相关的基因。研究的核心目标是通过高通量筛选技术，揭示影响神经元活动的基因，并探索这些基因在神经疾病中的潜在作用。

方法概述

1. CRISPRi技术：CRISPRi是一种基因沉默技术，通过引导dCas9蛋白结合到目标基因的启动子区域，从而抑制基因的转录。该研究利用CRISPRi技术构建了一个针对神经活动相关基因的自定义sgRNA库。

2. CaMPARI2标记系统：CaMPARI2是一种用于标记神经元活动的光转换蛋白，通过检测红/绿（R/G）比率的变化来反映神经元的活动状态。研究中，CaMPARI2被用于筛选出高活性和低活性神经元群体。

3. 高通量筛选：研究使用了FACS（荧光激活细胞分选）技术，根据CaMPARI2的R/G比率对神经元进行分选，并结合下一代测序技术分析sgRNA的丰度变化。

4. 数据分析：使用了sgcount和crispr_screen等生物信息学工具进行数据分析，评估每个基因的影响，并通过火山图和散点图展示结果。

实验设计与实施

• 初级筛选：研究首先进行了初级筛选，使用CRISPRi-NGN2-CaMPARI2 iPSCs感染sgRNA库，并在分化为神经元后进行FACS分选。通过对高活性和低活性群体的基因组DNA进行测序，识别出影响神经元活动的基因。

• 二级筛选：针对初级筛选中识别出的基因，进行了更为集中的二级筛选。使用了一个包含1211个sgRNA的二级筛选库，进一步验证这些基因的功能。

• 验证实验：通过qPCR和电生理学实验验证筛选结果，确保识别出的基因确实对神经元活动产生影响。

结果与发现

• 基因识别：研究识别出多个与神经活动相关的基因，这些基因在神经疾病中可能扮演重要角色。

• 功能验证：通过功能验证实验，确认了部分基因在调控神经元活动中的作用。

• 数据共享与工具开发：研究中使用的sgcount和crispr_screen工具被公开，以便其他研究人员使用。

贡献与意义

该研究通过结合CRISPRi技术和CaMPARI2标记系统，提供了一种高效的基因筛选方法，能够快速识别与神经活动和神经疾病相关的基因。这一方法不仅为神经科学研究提供了新的工具，也为理解神经疾病的分子机制提供了新的视角。

术语解释

• CRISPRi：一种基因沉默技术，通过抑制基因的转录来研究基因功能。
• CaMPARI2：一种用于标记神经元活动的光转换蛋白，通过光照改变其荧光特性。
• FACS：荧光激活细胞分选技术，用于根据细胞的荧光特性进行分选。
• sgRNA：单导向RNA，用于引导CRISPR系统靶向特定基因。

总结

该研究通过创新的实验设计和技术组合，成功识别并验证了多个与神经活动相关的基因，为神经科学研究提供了重要的工具和数据支持。研究结果不仅有助于揭示神经活动的分子基础，也为神经疾病的研究和治疗提供了新的潜在靶点。