用于细胞内肽组和小蛋白组分质谱分析的通用工具集

该文档主要介绍了一种用于分析细胞内肽组的新方法，强调了其在定量液相色谱-质谱（LC-MS/MS）中的应用。研究的重点是开发一种高效且可重复的样品制备方法，以便从哺乳动物细胞中提取和分析短肽和小蛋白质。

研究背景与目的

近年来，肽组学分析在生物学研究中得到了广泛应用，尤其是在体液中的生物标志物分析、信号肽、主要组织相容性复合体（MHC）肽配体以及短开放阅读框（sORFs）衍生蛋白的鉴定等方面。然而，现有的肽提取方法效率低下，且需要大量的样品输入。本文旨在通过开发一种新的样品制备和分析方法，克服这些挑战，实现对细胞内短肽和小蛋白质的高效定量分析。

方法与技术

研究中采用了一种结合简单变性和固相萃取的样品制备方法，适用于分离所需长度范围内的短肽。通过超滤调整质量范围，研究人员展示了该方法在富集和分级小蛋白质方面的高效性。质谱分析使用了Orbitrap Exploris 480，结合FragPipe/DIA-NN软件进行数据分析。该方法的一个关键特点是其数据无关采集（DIA）技术，能够在不丢失数据的情况下实现高通量的肽组定量。

结果与发现

1. 肽长度分布：研究表明，较长的肽在定量分析中更为有效。通过DIA方法，研究人员能够定量分析16076种细胞内肽。

2. 肽电荷状态分布：分析显示，识别出的肽的电荷状态与典型的蛋白质组实验一致，表明该方法在处理胰蛋白酶消化样品时的有效性。

3. 定量分析的再现性：在A375野生型和p53敲除细胞系的三次生物重复实验中，研究保持了组内相关系数（Pearson R2）高于0.8，并检测到74种显著调节的肽。

4. 生物学意义：研究发现，细胞内肽组的变化反映了蛋白质的天然蛋白水解处理或表达变化。功能分析表明，p53敲除影响了与p53通路相关的蛋白质来源的肽。

5. 肽末端位置分析：研究发现，细胞内肽在可能的全长蛋白质来源中的N端和C端肽过度表达，这可能与蛋白酶的特异性有关。

6. 氨基酸组成分析：肽末端的氨基酸组成分析显示，切割位点富含疏水性氨基酸，表明参与肽加工的蛋白酶具有胰凝乳蛋白酶样特异性。

结论与贡献

本文提出了一种新颖的细胞内肽组分析方法，能够高效、可重复地从哺乳动物细胞中提取和定量分析短肽和小蛋白质。该方法不仅提高了肽的识别深度，还展示了其在功能分析中的潜力，为理解细胞内肽组的生物学意义提供了新的视角。研究结果表明，该方法在基础科学（如蛋白质周转、蛋白水解处理）和应用科学（如生物活性肽发现、精准医学）中具有广泛的应用前景。

专业术语解释

• 细胞内肽组：指细胞内存在的短肽集合，通常由蛋白质降解产生。
• 定量液相色谱-质谱（LC-MS/MS）：一种用于分离和分析复杂混合物中化合物的技术。
• 数据无关采集（DIA）：一种质谱数据采集方法，能够在不丢失数据的情况下进行高通量分析。
• 超滤：一种用于分离不同分子量物质的技术，通过选择性过滤实现。

通过本文的方法，研究人员能够更好地理解细胞内肽组的复杂性及其在生物学过程中的作用，为未来的研究提供了重要的工具和方法。